徠卡體視顯微鏡對(duì)組織切面的觀察

以前所介紹的徠卡體視顯微鏡各種方法都是觀察生物組織自然表面的方法，而這里要介紹的是用徠卡體視顯微鏡掃描電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)部與實(shí)質(zhì)性器官內(nèi)部的方法。該方法由日人田中敬一始建，稱割斷法（此為日文漢字，直接被國(guó)入借用而未進(jìn)行翻譯）。其含義是用刀借助切斷包埋劑而切開(kāi)組織細(xì)胞，使其內(nèi)部結(jié)構(gòu)暴露，從而進(jìn)行觀察。以樹(shù)脂割斷法為例，簡(jiǎn)要介紹如下：

徠卡體視顯微鏡樹(shù)脂割斷法是zui早創(chuàng)始的割斷法。常用的樹(shù)脂為Arald比（在一300c固化），也可使用Epon812（一80℃固化）。徠卡體視顯微鏡的方法的要點(diǎn)是用樹(shù)脂包埋后，不要使樹(shù)脂聚合，而是在低溫下使之固化。割斷后恢復(fù)到常溫時(shí)用有機(jī)溶劑再洗去樹(shù)脂。樣品的取村、固定、脫水過(guò)程與透射電鏡標(biāo)本全同。脫水后的樣品經(jīng)氧化丙烯置換后放入膠囊中。樣品放入前膠囊內(nèi)預(yù)先裝好村脂。與透射電鏡樣品制備不同的是只需樹(shù)脂本身，而不加增塑劑與聚合劑等。樹(shù)脂對(duì)樣品的浸透也不必*充分，浸透不充分的樣品有時(shí)會(huì)給出有趣的斷面。一般說(shuō)來(lái)經(jīng)過(guò)一夜的浸透后便可將膠囊放至低溫冰箱、干冰或液氮中固化，然后將樣品“割斷”。割斷的步驟是先在冷凍的膠囊表面橫劃一溝痕將單面剃須刀片或多葉木工刀的刀刃垂直放在溝疽內(nèi)，用一木梯以適當(dāng)?shù)牧α壳脫舻侗常z囊被敲斷時(shí)其中的樣品隨之震裂。樣品的斷裂面如玻璃被割開(kāi)那樣光潔。將斷裂的膠囊投入氧化丙烯中，使樹(shù)脂镕去，樣品離開(kāi)放囊。更換數(shù)次氧化丙烯使樹(shù)脂*滑除，然后樹(shù)樣品移入醋酸異戊6中進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥。

徠卡體視顯微鏡需指出的是經(jīng)割斷法制備的標(biāo)本需要用高分辨率的掃描電鏡（如場(chǎng)發(fā)射電子槍掃描電鏡）進(jìn)行觀察。一般的掃描電鏡分辨率低于透射電鏡，若用掃描電鏡割斷法觀察組織、細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，以和透射電鏡團(tuán)相對(duì)比，必須用場(chǎng)發(fā)射電子槍掃描電鏡。由于掃描電鏡立體感較強(qiáng)，割斷樣品在鏡下顯現(xiàn)出高爾基扁平囊與大泡、小泡的空間分布；線粒體峭像隔板一樣伸展；核糖體像小蘑菇一樣附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)“板”上。盡管如此，有些學(xué)者認(rèn)為割斷法并未提供細(xì)腦結(jié)構(gòu)的新信息。因此該方法應(yīng)用不廣泛。

徠卡體視顯微鏡除樹(shù)脂割斷法外，尚有有機(jī)溶劑（酒糟、酷酸異戊圈等）割斷法；水溶性包埋劑（二甲基亞礬、甘油等）割斷法及其它（冷凍、氟里昂等）割斷法，操作都很容易。再以酒精割斷法為例：樣品固定后用酒精脫水，當(dāng)脫水完成后，將樣品投入預(yù)先裝有無(wú)水乙醇的膠囊中（避免出現(xiàn)氣泡）。將膠囊放在低溫裝置內(nèi)使乙醇固化。進(jìn)行樣品割斷。割斷的樣品立即進(jìn)入置于室溫的無(wú)水乙醇中，待乙醇融化后移入醋酸異戊酷、進(jìn)行臨界點(diǎn)干保。

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